In situ hibridizacija

in situ hibridizacija je metoda za otkrivanje kromosomskih aberacija. Određeni kromosomi obilježeni su fluorescentnim bojama i vezani za DNK sondu. Ova se tehnika koristi za prenatalnu dijagnozu genskih mutacija.

Što je in situ hibridizacija?

U slučaju in situ hibridizacije ili Fluorescencija in situ hibridizacija nukleinske kiseline iz RNA ili DNK detektiraju se u određenim tkivima ili stanici pomoću molekularno genetskih metoda. Obično se ova vrsta dijagnoze koristi za otkrivanje strukturne ili numeričke kromosomske nepravilnosti tijekom trudnoće.

U tu svrhu koristi se umjetno proizvedena sonda koja se sama sastoji od nukleinske kiseline. Zatim se veže na nukleinske kiseline u organizmu pomoću spajanja baza. Ta se veza podrazumijeva pod nazivom hibridizacija. Dokazi se temelje na živoj strukturi pacijenta i stoga odgovaraju in-situ dokazima. To se mora razlikovati od in vitro metoda u kojima se otkrivanje vrši u epruveti. Metodu su u 20. stoljeću razvili znanstvenici Joe Gall i Mary Lou Pardue.

Tehnologija se od tada razvijala. Dok su se u to vrijeme koristile radioaktivne sonde, na primjer, danas se koriste fluorescencijske sonde s kovalentnom vezom na molekule markera.

Funkcija, učinak i ciljevi

In-situ hibridizacija se obično koristi za otkrivanje kromosomske aberacije, tj. Kromosomske anomalije koje se ne mogu otkriti u kariogramu. To znači da se metoda uvijek koristi kada se utvrđuju nasljedne bolesti tijekom trudnoće.

Budući da su kromosomske aberacije problem koji danas ne treba podcijeniti, upotreba metode s vremenom je sve veća. Hibridizacija se odvija na temelju nativnih stanica majčine amnionske tekućine. Temelj tehnologije je vezivanje sonde s oznakom u boji na dijelove DNK. Zahvaljujući vezanju, broj primjeraka kasnije se može procijeniti mikroskopom, jer pojedine kopije emitiraju svjetlosni signal i na taj način mogu biti vidljive pod mikroskopom. Postoje različiti postupci. Ili se analiza odvija odmah nakon vezanja.

U ovom se slučaju koristi fluorescentna boja poput biotina koja je vezana izravno na DNA sondu. S neizravnom metodom in-situ hibridizacije procjena se ne može izvršiti odmah nakon hibridizacije, jer se fluorescentne tvari mogu vezati na sondu tek nakon hibridizacije. Ova se neizravna metoda koristi češće od izravne jer se vjeruje da je osjetljivija. Pored DNK sonde za centrometar specifične za kromosom, postoje i DNK sonde specifične za lokus, DNK biblioteke specifične za kromosom i usporedne hibridizacije genoma.

Centrometri specifične za kromosom DNK sonde mogu se koristiti za otkrivanje kromosomski numeričkih anomalija. To znači da se oni uglavnom koriste kada postoji sumnja na duplicirane ili izbrisane kromosome. Lokalno specifične DNA sonde posebno su pogodne za otkrivanje minimalnih mutacija koje se ne mogu otkriti u kariogramu. Hromosomska specifična biblioteka DNA koristi se posebno za otkrivanje umetanja i translokacija.

Uporedna hibridizacija genoma, s druge strane, sveobuhvatna je analiza gubitaka i dobitaka kromosomskog materijala. Danas je in-situ hibridizacija vrlo važna u dijagnozi različitih mutacija kromosoma.U dijagnozi Downovog sindroma, na primjer, sonde se vežu na kromosom 21. U tu se svrhu obično koriste sonde specifične za kromosom, koje se mogu upotrijebiti ako se sumnja na ovu bolest.

Sumnja može nastati, na primjer, ako su roditelji prethodno rodili dijete s tom bolešću, a slika ultrazvuka je nenormalna. Ako postoji trostruka umjesto dvostruke veze i na taj način se emitira signal trostruke boje, dijagnoza se smatra potvrđenom.

Rizici, nuspojave i opasnosti

Za razliku od, na primjer, PCR-a, in situ hibridizacija znatno je manje osjetljiva na kontaminaciju. Pored toga, vrijeme potrebno za postupak znatno je manje. Međutim, budući da embriji posebno formiraju uzorke kromosoma, uzorak se ne može koristiti sa sigurnošću da se odredi ostatak kromosomske raspodjele, a time i genetski status ostalih stanica.

Signali u boji također se mogu preklapati ili ostati nevidljivi iz drugih razloga. Kao rezultat, in situ hibridizacija kao dijagnostički alat relativno je sklona greškama tijekom trudnoće. Pogrešne dijagnoze mogu nastati i roditelji se mogu odlučiti protiv zdravog embrija. Da bi se smanjila osjetljivost na pogreške in situ hibridizacije, potrebno je istodobno pregledati najmanje dvije embrionalne stanice. Ispitivanjem dviju stanica paralelno, sada postoji samo zanemariv rizik od pogrešne dijagnoze.

U takvom slučaju roditelji se mogu apsolutno osloniti na dijagnozu. In-situ hibridizacija nije ponuđena svakoj trudnici, već samo ženama iz rizične skupine. Ipak, trudnicama ne uskraćuje se ova vrsta dijagnoze na vlastiti zahtjev. Nenormalni ultrazvučni nalazi ili abnormalni serum mogu navesti liječnika da ponudi dijagnostički postupak. Iako se veliki dio, ali nikako sve, aberacije kromosoma može dijagnosticirati primjenom in situ hibridizacije.

Stoga se in situ hibridizacija nikada ne smije provoditi sama, već se uvijek mora koristiti zajedno s konvencionalnim testom kromosoma. Njega trudnice igra glavnu ulogu u ovom postupku. Prije analize slijedi dubinska rasprava s budućom majkom o dijagnostičkoj metodi koja objašnjava rizike, mogućnosti i granice tehnologije.